Detecção de HOCl

Scientific Reports volume 12, Artigo número: 10329 (2022) Citar este artigo

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Os biomateriais artificiais podem aumentar significativamente a taxa de regeneração tecidual. No entanto, a implantação de andaimes leva não só à aceleração da cicatrização tecidual, mas também a uma resposta imunológica do organismo, o que resulta na degradação do biomaterial. A sinergia da resposta imune e dos processos de degradação do andaime determina em grande parte a eficiência da regeneração tecidual. Ainda assim, métodos adequados para caracterização rápida, precisa e não invasiva do grau de degradação do biomaterial são altamente exigidos. Aqui mostramos a possibilidade de monitorar a degradação de estruturas de pericárdio bovino descelularizadas sob condições que mimetizam a resposta imune e os processos de oxidação usando tomografia multifotônica combinada com imagens de fluorescência vitalícia (MPT-FLIM). Descobrimos que os tempos de vida de fluorescência das ligações cruzadas induzidas pela genipina no colágeno e nos produtos de oxidação do colágeno são marcadores proeminentes da degradação oxidativa dos andaimes. Isto foi verificado em experimentos modelo, onde a oxidação foi induzida com ácido hipocloroso ou por exposição a neutrófilos ativados. Os parâmetros de decaimento de fluorescência também se correlacionaram com as alterações das propriedades micromecânicas dos andaimes, conforme avaliado por microscopia de força atômica (AFM). Nossos resultados sugerem que o FLIM pode ser utilizado para avaliações quantitativas das propriedades e degradação dos andaimes essenciais para os processos de cicatrização de feridas in vivo.

Na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa, os andaimes fornecem suporte mecânico e sinais bioquímicos para garantir a sobrevivência e diferenciação celular1. A descelularização de tecidos e órgãos animais permite a fabricação de matriz extracelular (MEC) que mantém as propriedades mecânicas e bioquímicas da MEC nativa e constitui um nicho ideal para a regeneração tecidual2,3. O biomaterial estimula o recrutamento celular e a remodelação tecidual e, ao mesmo tempo, degrada-se gradativamente. A taxa e os mecanismos de degradação do andaime determinam em grande parte a resposta imunológica à implantação do andaime e a eficiência da cicatrização de feridas.

O pericárdio bovino descelularizado (PAD) é de particular interesse na medicina devido à sua disponibilidade, biocompatibilidade e propriedades físico-químicas ajustáveis4. O PAD é um material barato e robusto, amplamente utilizado em cirurgia cardíaca, ortopedia, cirurgia geral e pulmonar e odontologia5. A reticulação do DBP por agentes químicos como glutaraldeído, compostos epóxi e genipina modula a imunogenicidade do biomaterial, melhora sua estabilidade proteolítica e prolonga sua degradação4,6. No entanto, o atraso indevido da degradação do andaime pode resultar na resposta inflamatória excessiva e na formação de corpo estranho. Portanto, o projeto de novos agentes de reticulação e a otimização da arquitetura e degradação do andaime são um ponto importante na medicina regenerativa7.

A implantação de andaimes inicia a resposta imune, em que os neutrófilos são as primeiras células imunes recrutadas e ativadas no local do dano tecidual8,9. A ativação de neutrófilos é acompanhada pela secreção de proteínas (por exemplo, colagenase, gelatinase) de grânulos intracelulares capazes de degradar os biomateriais. Além disso, os neutrófilos ativados liberam mieloperoxidase (MPO) que – na presença de H2O2 – gera ácido hipocloroso (HOCl). O HOCl é um poderoso agente oxidante que pode oxidar e degradar não apenas moléculas biológicas, mas também nanomateriais à base de carbono .

Técnicas físicas, como a microscopia de força atômica (AFM), têm sido empregadas com sucesso para avaliar as mudanças nas propriedades estruturais e degradação de andaimes13,14,15,16. Os métodos ópticos também permitem uma rápida avaliação quantitativa das propriedades físico-químicas dos biomateriais, bem como sondar o estado metabólico das células circundantes. Particularmente promissora é a aplicação da tomografia de fluorescência multifotônica combinada com imagens de fluorescência vitalícia (MPT-FLIM), que permite visualizar as camadas mais profundas do tecido com contraste molecular específico . O MPT-FLIM já foi utilizado para caracterizar a degradação de estruturas à base de colágeno18,19,20,21,22,23. O FLIM combinado com a espectroscopia Raman também permite avaliar o grau de reticulação em estruturas de pericárdio contendo colágeno usando o sinal de fluorescência das ligações cruzadas induzidas pela genipina . O FLIM multiespectral foi utilizado para monitorar a degradação enzimática do colágeno em estruturas de pericárdio bovino20. A estereomicroscopia de fluorescência e a tomografia multifotônica foram utilizadas em conjunto com ensaios imuno-histoquímicos e microtomografia para obter informações sobre a degradação da PAD ex vivo21. O FLIM de fibra óptica foi aplicado para rastrear a dinâmica da recelularização da superfície do andaime, monitorando as mudanças no tempo de vida da fluorescência . Os parâmetros do tempo de vida da autofluorescência dos produtos de oxidação do colágeno e das ligações cruzadas também podem ser usados ​​para caracterizar os colágenos naturais e sua degradação in vivo . No entanto, a modificação dos biomateriais de colágeno induzida pelas células imunes não foi avaliada por técnicas ópticas.