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Scientific Reports volume 13, Artigo número: 3625 (2023) Citar este artigo

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A pesquisa baseada em biochips está atualmente evoluindo para uma base tridimensional e em grande escala, semelhante ao microambiente in vivo. Para imagens vivas e de alta resolução de longo prazo nessas amostras, a microscopia não linear capaz de gerar imagens multiescala e sem rótulo está se tornando cada vez mais importante. A combinação com imagens de contraste não destrutivas será útil para localizar eficazmente regiões de interesse (ROI) em amostras grandes e, consequentemente, minimizar o fotodano. Neste estudo, uma microscopia de coerência óptica fototérmica sem rótulo (OCM) serve como uma nova abordagem para localizar o ROI desejado em amostras biológicas que estão sob investigação por microscopia multifotônica (MPM). A fraca perturbação fototérmica na amostra pelo laser MPM com potência reduzida foi detectada nas partículas fototérmicas endógenas dentro do ROI usando o OCM fototérmico diferenciado por fase altamente sensível (PD-PT). Ao monitorar a mudança temporal do sinal de resposta fototérmica do PD-PT OCM, o hotspot gerado dentro da amostra focada pelo laser MPM foi localizado na ROI. Combinado com o movimento automatizado da amostra no eixo x-y, o plano focal do MPM pode ser efetivamente navegado até a porção desejada de uma amostra volumétrica para imagens de MPM direcionadas de alta resolução. Demonstramos a viabilidade do método proposto em microscopia de geração de segundo harmônico utilizando duas amostras fantasmas e uma amostra biológica, um inseto fixo em lâmina de microscópio, com dimensões de 4 mm de largura, 4 mm de comprimento e 1 mm de espessura.

A microscopia multifotônica (MPM) permite análises de alta resolução em vários campos de pesquisa biológica. Nos últimos anos, o uso do MPM continuou a ganhar atração em imagens biomédicas, especialmente em áreas de imagens de neurônios profundos in vivo e vivos em pequenos animais1,2,3,4,5, detecção precoce de tumores e sua caracterização6,7, 8,9, rede vascular e imagem organoide em seu microambiente em biochips10,11,12. Tem havido muitas abordagens para aumentar a profundidade da imagem, maior campo de visão (FOV) e reduzir o tempo de varredura volumétrica, adotando fluoróforos apropriados13, óptica adaptativa14, mecanismos multifeixe e multifocais15,16, além de outras modificações semelhantes na configuração óptica que forneceu variações de sistemas de imagem MPM adotáveis ​​de acordo com as necessidades de imagem e cenários de aplicação 5,16,17,18,19,20,21.

Fotodano e fotodegradação são fatores críticos a serem considerados em imagens multifotônicas. Iluminação prolongada acompanhada de alta potência de laser necessária para imagens multifotônicas sem rótulo, há fotomecanismo de dano tecidual que resulta em aumento de fluorescência causando morte celular, que é amplamente referida como fotodano 22,23,24. Para evitar a ocorrência de fotodano em células vivas, deve-se tomar cuidado para garantir que os parâmetros de imagem estejam bem abaixo do limiar de fotodano, como intensidade de pico, taxa de repetição e tempos de exposição prolongada (permanência) . A maioria desses parâmetros pode ser controlada pelos sistemas de fonte e detecção. Vários grupos de pesquisa estudaram e propuseram várias abordagens para suprimir os efeitos do fotodegradação e do fotodano. O método mais simples e mais adotado é reduzir a potência total de iluminação de uma fonte de luz4,25,26. No entanto, isto, por sua vez, reduz a sensibilidade geral do sistema devido à redução da relação sinal-ruído. Abordagens alternativas relatadas para mitigar esse efeito envolvem um método controlado de exposição à luz que controla espacialmente a luz exposta na amostra, o uso de um divisor de pulso passivo que redistribui o pulso do laser de iluminação em subpulsos com energias iguais e uma varredura óptica rápida mecanismo que reduz o fotodano controlando a iluminação e coleta de emissão dos espécimes27,28,29,30. Além disso, utilizando o método de iluminação por folha de luz, apenas o plano focal da objetiva de detecção é efetivamente iluminado31. Embora esses métodos sejam úteis para reduzir os efeitos de fotodano e fotodegradação, a iluminação de alta potência e de longo prazo é necessária ao procurar a região de interesse (ROI) em amostras grandes com pequenos FOVs e longos tempos de varredura volumétrica, resultando em fotodano e fotodegradação.